Что такое ПЦР диагностика туберкулеза?
Современная ПЦР-диагностика туберкулеза

Современная ПЦР-диагностика туберкулеза

Туберкулез, он же бугорчатка, он же чахотка,— это заболевание, древнее как мир. Туберкулезом болеют и люди и животные, он передаётся, в основном, по воздуху, так же, как грипп, или та же коронавирусная инфекция.

Однако медицина не стоит на месте и наряду с традиционными способами диагностики туберкулезной инфекции применяется и самый современный способ, основанный на молекулярно-генетической диагностике, а именно ПЦР в реальном времени или «реал-тайм» ПЦР-диагностика туберкулеза.

Тревожная эпидемиология

Туберкулез до сих пор по всему миру считается инфекцией с высоким риском заболеваемости, и высокой смертностью. Больше всего в 2018 году погибло людей от туберкулеза в Индии, почти 450000 человек только доказанных случаев, когда туберкулез явился непосредственной причиной смерти. Самой эпидемически неблагоприятной страной, в которой больше всего больных туберкулезом, является Центральноафриканская республика (ЦАР), в которой на 100 тысяч жителей более 500 больных, то есть показатель заболеваемости туберкулезом охватывает полпроцента населения.

Что касается Российской Федерации, то, по данным ВОЗ, оно входит в число тех 22 стран мира, в которых ситуация по туберкулезной инфекции наименее благоприятна. И, несмотря на то, что мы без пользы для народного хозяйства пережили «тучные 2000-е», с высокими ценами на нефть, до сих пор в России принято винить в росте туберкулезной инфекции «проклятые девяностые». Эпидемия ВИЧ-инфекции лечится плохо, по устаревшим схемам, с длительным отсутствием гарантированных препаратов, что и способствует распространению туберкулеза.

В Российской Федерации в настоящее время идет эпидемия ВИЧ-инфекции, которая вышла за резервуары внутривенных наркоманов и лиц, практикующих однополые незащищенные контакты. В настоящее время ВИЧ-инфекцией могут заразиться совершенно не имеющие отношения к группам риска люди. А ВИЧ-инфекция, и, тем более, ее финал — СПИД, также относятся к состояниям, значительно ухудшающим иммунитет, и поэтому очень часто сопровождаются вторичным заражением туберкулёзом. Очень велик риск заболеть туберкулезом при пребывании в исправительных учреждениях, там и туберкулез, и ВИЧ-инфекция, к сожалению, стали печальной реальностью.

Россия, в том числе, является страной, в которой возникают устойчивые формы туберкулеза, так же, как в Китае и Индии, которые с трудом поддаются лечению и требуют назначение резервных антибиотиков.

Высокая заболеваемость туберкулезом в России у лиц, с низким прожиточным уровнем, у стариков, пациентов перенёсших пересадку органов, у лиц с хронической почечной недостаточностью, ревматической патологией, которые принимают иммуносупрессоры. Напрасно считать туберкулез давно побежденной болезнью. В настоящее время, в связи со старением населения в развитых странах, участилась заболеваемость сахарным диабетом, а это заболевание тоже сильно угнетает иммунитет, и часто сопровождается туберкулезной инфекцией.

По-прежнему большой риск заболеть у детей, а также контактным лицам, которые общаются или ухаживают за больными туберкулезом. Не стоит сбрасывать со счетов наркоманов, бомжей и бездомных, а также нелегальных трудовых мигрантов.

Следует помнить, что до сих пор туберкулез — это самая частая причина смерти от инфекционного заболевания у взрослого человека. Туберкулез вызывается микобактерией, и «изюминкой» структуры этих возбудителей можно считать уникальную клеточную стенку, которая не поддается влиянию кислой среды, и поэтому сквозь неё очень трудно пробраться антибиотикам. Кроме человеческой микобактерии туберкулеза, человек может болеть и бычьим туберкулезом, который вызывается mycobacterium bovis. В этом случае заражение происходит чаще всего уже не воздушно-капельным путем, а через продукты, например, через молоко, через поверхность раны, которая может инфицироваться возбудителем, и даже с помощью внутриутробного, вертикального пути передачи, от больной матери к ребёнку.

Возбудитель туберкулеза очень коварен, и благодаря уникальному строению клеточной стенки, он долго сохраняется в природе. Так, даже высохшая инфицированная мокрота больного способна сохранять контагиозность до 10 месяцев. Окружающие больного, выделителя палочек, или БК+, личные вещи и предметы, например книги, мебель и белье способны быть заразными около 90 дней. В почве возбудитель туберкулеза способен жить до полугода, а в воде и дольше года, что и обеспечивает большой уровень заболеваемости и смертности в жарких странах, например, Индии.

Активный процесс, латентная стадия или элиминация?

Конечно, развитие туберкулезной инфекции полностью зависит от многих условий, в том числе от иммунного статуса и резистентности организма. Если микобактерия попала в небольшом количестве к человеку с крепким иммунитетом, то она полностью выводится из организма, то есть элиминируется. Если у человека очень низкий иммунный статус, например вследствие приема цитостатиков ииммуносупрессантов, или на поздних стадиях развития ВИЧ-инфекции, то микобактерия быстро размножается, и возникает первичный активный туберкулез.

Наконец, в том случае, если туберкулёз укрепился в организме, и не хватает иммунитета ликвидировать возбудителя, но одновременно напряженность иммунитета достаточна, чтобы предотвратить быструю и активную форму болезни, то тогда возникает так называемая латентная туберкулезная инфекция. Это своеобразная окопная, позиционная, война с двух сторон – макроорганизма и возбудителя, вовлеченных в затяжной процесс. Она характеризуется высокой напряженностью противотуберкулезного иммунитета, при отсутствии всяких симптомов активной формы.

Но при этом присутствующий в организме при латентной инфекции возбудитель способен при малейшем падении иммунной защиты активизироваться, интенсивно размножаться, или проявлять себя спустя долгое время кажущегося благополучия, что называется реактивацией туберкулезного процесса.

Статистика показывает, что:

  • с момента проникновения инфекции только 5% всех лиц в течение первого года вовлекаются в активный туберкулезный процесс;
  • если туберкулёз не развивается в первый год, то ещё 5% всех инфицированных лиц могут заболеть в течение оставшейся жизни, поэтому в случае инфицирования риск получить активную форму в совокупности составляет 10% улиц с нормальным иммунным статусом;
  • если речь идет о группах риска, например у пациентов еще и с ВИЧ-инфекцией, то в этой группе инфицированных ежегодный риск получить активный процесс будет составлять 10%;
  • ровно 50% шансов, или 1/2 за то, что в течение жизни он заболеет туберкулёзом с клиническими проявлениями, и при этом вовсе еще не говорится о рисках на стадии СПИДа.

Ситуация усугубляется еще и особенностями жизненного процесса микобактерий туберкулеза. Они способны длительно паразитировать внутри макрофагов, которые поглощают микобактерии с целью их уничтожить. Однако, уничтожить микобактерии туберкулеза у них не получается, и эта внутриклеточная персистенция составляет дополнительный риск долгого сосуществования организма и микобактерии.

Кстати, дополнительным фактором риска, который повышает вероятность заболеваемости туберкулеза вчетверо, является курение, особенно если человек выкуривает более 20 сигарет в день.

Усугубляет ситуацию отсутствие признаков болезни при латентной инфекции. Однако если заболевание переходит в активную фазу, то тогда появляются всем известные, веками известные симптомы туберкулёза. Это такие симптомы, как:

  • слабость и вялость, быстрая усталость и истощаемость;
  • обильная ночная потливость;
  • субфебрильная лихорадка;
  • появление в типичных случаях легочного туберкулеза кашля, подкашливания с мокротой;
  • прогрессирующая потеря массы тела.

Как же можно обнаружить микобактерии современными методами?

О диагностике: классика и современность

Классическим, очень надежным, но, увы, и одновременно медленным способом найти возбудителя является выделение чистой культуры на питательной среде, определении морфологических и культуральных свойств микроба, с определением серологических вариантов. Однако, микобактерии в лаборатории, то есть, инвитро, растут чрезвычайно медленно, и после взятия материала, даже при идеальном соблюдении абсолютно всех правил лабораторной техники и условий идеального роста можно ожидать до полутора месяцев.

Чаще всего берут для посева мокроту, а затем, после размножения возбудителя на средах, проводят микроскопию посева с окрашиванием. Этот метод, конечно, высокоспецифичен, и спутать туберкулезную палочку ни с какой другой нельзя, но при этом способ обладает недостаточной чувствительностью. Если культура растёт плохо, то концентрация микробов в образце будет недостаточной, и диагноз будет не подтвержден. В том случае, если речь идет о ВИЧ-инфицированном пациенте, о пациентах пожилого возраста, или о ребёнке, то может быть трудность со сбором мокроты, а случае низкого иммунитета пациенту вполне хватит и малой концентрации возбудителя для активного процесса.

Неужели нет никаких иных методов? Конечно, есть, и это классическое рентгенологическое исследование легких. Но рентген, к сожалению, может быть применим только в случае классических лёгочных форм.

Быстрая, то есть скрининговая диагностика может быть проведена при определении специфических антител, с помощью метода ИФА. Так, активная стадия будет характеризоваться значительный выработкой антител сначала класса М, а потом и Ig G, и они могут быть выявлены уже через месяц после активизации процесса. Однако, картина такого иммунного ответа на туберкулез с помощью антител достаточно капризна, индивидуальна и неоднозначна. В некоторых случаях иммуноглобулины класса М не встречаются вовсе, у детей они могут появляться, напротив, при достаточно длительных сроках болезни, что противоречит механизму их образования, как антител «быстрого реагирования», а иногда, и клинической картине. Чувствительность современных тест-систем с использованием антител может быть около 60%, например, в случае туберкулеза лимфатических узлов, и при высокой специфичности не давать точного диагноза. Что же такое ПЦР-диагностика туберкулеза?

ПЦР: универсальность и быстрота

Поэтому в настоящее время самым быстрым и чувствительным методом может являться ПЦР в реальном времени, то есть полимеразная цепная реакция, анализ ПЦР на туберкулез. Она основана на генетических механизмах многократного увеличения копий участков ДНК, характерных для возбудителей туберкулеза с их последующей идентификацией. Это современные методы молекулярной биологии, которые позволяют со 100% точностью, умножить участки генома микобактерии до концентрации уверенного распознавания, и определить именно возбудителя туберкулёза, причём с высокой скоростью.

Применение «ПЦР-туберкулез» в реальном времени позволяет уже на следующий день, а при необходимости и даже в день сдачи анализов получить ответ, есть ли в образце возбудитель туберкулёза, или его нет.

Этот метод позволяет определять возбудителя в разных образцах. Например, в крови. Анализ крови на ПЦР-туберкулез позволяет выявить грозную бактериемию. Феномен бактериемии, то есть нахождения возбудителя туберкулеза в крови у пациента чаще всего возникает на ранней стадии активной инфекции, если легочный туберкулез переходит во внелегочную форму, или при резкой генерализации процесса. Получение положительного заключения крови на ПЦР-туберкулез всегда очень опасно, и прогностически неблагоприятно, поскольку чревато или септическим шоком, или вялотекущим сепсисом. Особенно это тревожно у пациентов с ВИЧ-инфекцией на поздних стадиях, перешедших в синдром СПИДа.

Может быть туберкулезная бактериемия и у тех, кто страдает туберкулезом, но не лечится, перестал лечиться, и так далее. Важным преимуществом ПЦР по сравнению с исследованиями антител и постановкой туберкулиновых реакций состоит в том, что при ПЦР определяются непосредственно сами структуры туберкулезных клеток, то есть, наличие «первичного виновника». Результаты ПЦР не зависят от состояния иммунитета, его супрессии, виража туберкулиновых проб, и различных ложноотрицательных результатов, которые могут привести к неправильному выводу.

ПЦР, его проведение и результаты

Практически любую биологическую жидкость можно сдать на анализ ПЦР на туберкулез. Это может быть классическая мокрота, венозная кровь, или плевральная жидкость, взятая при плевральной пункции. Однако можно проводить исследования и биоптатов плотных тканей, цереброспинальной жидкости, или ликвора, взятой во время пункции, промывные воды бронхов, полученные во время проведения лечебной или диагностической бронхоскопии, или бронхоальвеолярный лаваж. Можно брать также и утреннюю мочу, или даже эякулят, содержащий сперму. Можно ставить ПЦР и на образце синовиальной жидкости, взятой при артроскопии, например, в случае изолированного воспаления коленного сустава. Туберкулезный гонит с одной стороны – это классика внелегочного туберкулеза, и об этом нужно помнить.

Поэтому проведение ПЦР при туберкулезе используется, прежде всего, чтобы поставить диагноз внелегочного туберкулеза, например, мочеполовой системы, часто протекающий скрыто, и приводящий к бесплодию.

Второе важное применение ПЦР — это оценка эффективности противотуберкулезного лечения. Кажется, все просто: если вначале в мокроте определялось наличие микобактерий, и ПЦР было (+), то после правильно проведенной терапии будет выведение из организма возбудителей, и соответственно, отрицательные значения ПЦР. Но это не совсем так. Реакция ПЦР может найти и мертвые, нежизнеспособные клетки, то есть обрывки ДНК погибших возбудителей после успешного лечения. Поскольку ПЦР не может отличить активного, живого возбудителя от мертвого, такая реакция будет являться ложноположительной, и её необходимо будет через некоторое время повторить, когда организм освободится и от мертвого бактериального балласта.

Нужно провести это исследование, чтобы своевременно выявить раннюю активацию, реактивацию или рецидив инфекции и не ждать полтора месяца результатов бактериологического посева. Очень важно своеобразно своевременно распознать высокий риск септического шока и проникновения микобактерий в кровяное русло. В таком случае делается ПЦР «по крови», когда у пациента на фоне классических симптомов туберкулезной инфекции есть потрясающий озноб и симптомы септического состояния. Это позволит своевременно применить мощные резервные противотуберкулезные средства, и спасти пациента.

Наконец, помогает ПЦР и в случае ВИЧ-инфекции, она нужна, чтобы решить проблему виража туберкулиновой пробы у ребенка, и важно своевременно назначить ПЦР на туберкулез детям, или просто в случае длительного контакта человека с больным туберкулезом.

Результаты ПЦР на туберкулез качественные, то есть «отрицательно» или «положительно». В норме результат должен быть отрицательным. Теперь мы надеемся, что уважаемый читатель составил себе понимание, что это такое — ПЦР-анализ на туберкулез.

Какие методы, кроме ПЦР на туберкулез, считаются современными?

Однако следует напомнить пациентам, что кроме ПЦР диагностики есть еще довольно высокоинформативный метод диагностики микобактерий, который называется t-spot. С помощью этого теста определяют иммунный ответ, который вызван Т-лимфоцитами. Определяют в крови Т-лимфоциты кластеров CD4 и CD8, которые вырабатывают гамма-интерферон. Затем в лабораторных условиях провоцируют эти лимфоциты на выработку интерферона специально подобранной стимуляцией особыми белками. Белки подобраны таким способом, что они существуют только у настоящих микобактерий туберкулеза, которые вызывают заболевание, но отсутствуют у безобидных микробов, с помощью которых производят вакцины, например БЦЖ.

Этот тест является довольно дорогим, его стоимость около 5000 руб., и понятно, почему: весьма дорогие реактивы, то есть, специфические туберкулезные белки. При этом в отличие от качественной реакции ПЦР он может количественно показать, «сколько» в организме человека туберкулеза. Конечно, условно, по напряженности имунной реакции. Поэтому он имеет особое значение в диагностике при наличии микст-инфекции: туберкулеза и ВИЧ. Дело в том, что вирус иммунодефицита человека поражает как раз Т-лимфоциты из кластера, или субпопуляции хелперов, или CD4. Поэтому даже в том случае, если на поздних стадиях ВИЧ-инфекции именно этих лимфоцитов очень мало, то этот способ позволяет выявлять напряженность остаточного иммунитета при туберкулезе.

Возможно вам также будет интересна наша статья Диагностика туберкулеза легких по анализам крови.